بررسی امکان ایجاد جهش های s390i و g191v در ژن کیتیناز serratia marcescens b4a با روش quik-change site directed mutagenesis به منظور بهبود بخشیدن پایداری آنزیم

کیتینازها، گلیکوزیل هیدرولازهایی هستند که با شکستن پیوند گلیکوزیدی بین زیرواحدها، پلیمر کیتین را تجزیه می کند. آنزیم کیتیناز اهمیت اقتصادی چشمگیری در خصوص تجزیه مواد کیتینی و پاکسازی محیط زیست و تهیه مواد پیش ماده و کنترل قارچ های پاتوژن گیاهی و آفات دارد. از طرفی آنزیم-های پایدار به دما از لحاظ صنعتی و بیوتکنولوژی بسیار مهم اند. آنزیم اندوکیتیناز حاصل از یک سوش باکتریایی (serratia marcescens b4a) با 567 اسیدآمینه تشابه زیادی به گلیکوزیل هیدرولاز های خانواده 18 (gh18)نشان می دهد. این آنزیم در زیرساختار وسیعی از ph (10-3) و دما(?c60-30) می تواند فعالیت کند و بیشترین فعالیت را در 6=ph و دمای?c 50 نشان می دهد. این ویژگی ها باعث تبدیل این کیتیناز به یک گزینه مناسب برای کارهای تحقیقاتی و همچنین کاربردهای صنعتی شده است. هم اکنون با روشهای مختلفی از جمله جهش زایی هدفمند، با تغییر یک سری از آمینواسیدها به آمینواسیدهایی که سختی آنزیم را افزایش می دهند، می توان پایداری آنزیم را تا حدی افزایش داد. روشی که در این تحقیق انتخاب شد quik-change site directed mutagenesis می باشد؛ جایگاه جایگزینی آمینواسیدی به گونه ای انتخاب شد که آمینواسید سرین 390 که در لوپ منتهی به بتا وجود دارد تبدیل به ایزولوسین شود که بیشتر تمایل دارد در زنجیره ی بتا باشد و همچنین در طی یک جایگزینی دیگر گلیسین 190 به والین تبدیل شد و به این ترتیب در این دو جایگاه به بررسی همزمان نقش کاهش طول لوپ و افزایش صفحات بتا و همچنین نقش آمینواسیدهای گلیسین و سرین به عنوان آمینواسیدهای غیرپایدارکننده و والین و ایزولوسین به عنوان آمینواسیدهای پایدارکننده پرداخته شد.نتایج بدست آمده نشان داد که دما و ph بهینه جهش یافته ها تغییر چندانی نکرده و این حاکی از آن است که جهش های ایجاد شده بر روی خصوصیات اصلی آنزیم تاثیری نداشته علاوه بر آن تغییر نکردن مقدار km نشان دهنده این است که جهش ها بر انعطاف پذیری کلی آنزیم و تمایل آنزیم به سوبسترا تاثیری نداشته است. نتایج حاصل از اندازه گیری پایداری جهش یافته ها به ph و دما نشان داد که پایداری آنزیم نسبت به ph و دما افزایش یافته، علاوه بر آن جهش یافته ها در دماهای 50 و 60 درجه سانتی گراد با گذشت زمان فعالیتشان بیش از پیش افزایش می یابد. یافته های ما نشان می دهد در اثر این جایگزینی ها کیتیناز فشرده تر و مدت زمان بیشتری فعالیت خود را در دمای ثابت حفظ کرده و دماهای بالا را به خوبی تحمل می کند.